۲/۱

۲۵

S5761

NaHCO3

۰/۳

۲/۰۴

C7902

CaCl2.2H2O

۰/۰۷۵

P7794

Penicillin-G

۰/۰۵

S9137

Streptomycin sulfate

۰/۲

P0290

Phenol red (1%)(mL/L)

۴

BSA

۲-۵- لقاح آزمایشگاهی
روز قبل از لقاح، ظروف و محیط­های کشت مورد نیاز را آماده کرده و به مدت ۱۲ ساعت قبل از لقاح جهت تعادل در داخل انکوباتور قرار داده شد.
۲-۵-۱- تهیه اسپرم
برای تهیه اسپرم از موش­های نر ۸ تا ۱۲ هفته استفاده شد. موش نر را به روش جابجایی گردن آسان کشی شدند که روش مذکور به این شرح است که با کشیدن بدن موش از طریق دم و فشار همزمان بوسیله میله صاف و یا انگشتان روی گردن بر روی میله­های فلزی قفس صورت می­گرفت (تصویر ۱-۲) بعد از کشتن حیوان به طریقه فوق­الذکر، پوست ناحیه شکمی را با اتانول ۷۰% استریل کرده و با ایجاد برش در ناحیه شکم (تصویر ۲-۲) و بعد از جدا کردن بافت­های همبندی اطراف دم اپیدیدیم را همراه با مقداری از کانال دفران از بیضه جدا کرده و در داخل پتریدیش ۶ سانتی متری حاوی محیط کشت HTF حاوی ۴ mg/ml BSA (Sigma, USA)، که قبلا جهت تعادل در داخل انکوباتور قرار داده شده بود قرار داده و پس از ایجاد چند برش در دم اپیدیدیم و فشار در کانال دفران برای خروج اسپرم­ها در داخل انکوباتور CO2 گذاشته می شدند. بعد از ۳۰ دقیقه اسپرم­ها خارج و در محیط پخش می شدند، (تصویر ۲-۳) سپس اسپرم­ها را شستشو داده و با بهره گرفتن از روش شناورسازی[۸۹] اسپرم­های متحرک را جدا نموده و جهت ظرفیت­یابی، اسپرم­ها به مدت یک ساعت در انکوباتور CO2 با دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرار داده شدند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

تصویر ۲-۲- آسان کشی حیوان
تصویر۲-۳- نحوه ایجاد برش در ناحیه شکم
تصویر۲-۴- نمایی از اسپرم در زیر میکروسکوپ ۱۰۰×
۲-۵-۲- بررسی کیفیت اسپرمبرای شمارش اسپرم ها رقت ۱ به ۲۰ از اسپرم های مذکور تهیه شد به این صورت که در داخل یک میکروتیوب ۱ میلی لیتری ۱۹۰ میکرولیتر آب مقطر ریخته و بعد به آن ۱۰ میکرولیتر از اسپرم مورد نظر را اضافه می کنیم و بعد ۱۰ میکرولیتر از محلول مورد نظر را برداشته و برروی لام نئوبار که لامل سنگی از قبل برروی آن قرار داده شده است ریخته و شمارش تعداد اسپرم ها به این روش انجام می شود.
برای سنجش وضعیت تحرک اسپرم مقدار ۱۰ میکرولیتر از محیط کشت حاوی اسپرم مورد نظر را بر روی لام نئوبار که لامل سنگی بر روی آن قرارداده شده است گذاشته ودر زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی ۲۰× درصد تحرک اسپرم ها بررسی گردید. در این مطالعه از نمونه های اسپرم با تحرک بالای ۸۰ درصد استفاده شد.
۲-۵-۳- بررسی قابلیت زنده ماندن اسپرم
جهت ارزیابی قابلیت زنده ماندن اسپرم از تست ائوزین نگروزین استفاده شد که مقدار ۲۰ میکرولیتر از نمونه اسپرم مورد نظر را در روی یک لام تمیز با ۲۰ میکرولیتر از محلول ائوزین حل کرده و پس از گذشت ۲۰ الی ۳۰ ثانیه ۲۰ میکرولیتر از محلول رنگی نگروزین به آن اضافه شد و پس از تهیه اسمیر از محلول مورد نظر و خشک شدن لام ها با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری و با بزرگنمایی ۴۰× درصد اسپرم های زنده (بی رنگ) و اسپرم های مرده (رنگ گرفته) مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه از اسپرم های با درصد بالای ۸۰ درصد اسپرم زنده استفاده شد.
۲-۵-۴- بررسی مورفولوژی اسپرم

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...