۳-۳-۲-۳- روش تهیه استوک^[۸۴] باکتری
برای تهیه استوک از باکتری­ های حاوی ساختار پلاسمید، ابتدا از باکتری مورد نظر کشت یک شبه^[۸۵] گذاشته شد. سلول­ها به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند و سوپ رویی دور ریخته شد. سپس به نسبت ۱:۱ گلیسرول استریل ۵۰% به محیط کشت LB اضافه شد. آن­گاه رسوب سلول­ها در حجم اولیه محیط کشت، از این محلول حل شدند. در آخر آمپی­سیلین با غلظت نهایی μg/ml 100 به سلول­ها اضافه شد و در C°۲۰- ذخیره گردید.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۳-۲-۴- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب
کلنی مورد نظر از بین باکتری­ های ترانسفورم شده انتخاب شد و به محیط کشت LB دارای آنتی بیوتیک آمپی­سیلین (μg/ml100) انتقال یافت. پس از رشد باکتری به مدت ۱۶ ساعت در دمای °C 37، کشت ۱ درصد تلقیح از نمونه باکتری رشد کرده، در حجم ml 20 محیط LB با آمپی سیلین ایجاد شد. پس از گذشت ۴ ساعت از کشت اولیه باکتری ها در دمای °C 37، زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به ۹/۰ رسید، با افزودن IPTG (با غلظت نهایی mM 1) به محیط های کشت بیان پروتئین نوترکیب القا شد و با کاهش دمای انکوباتور به °C 30 شرایط برای تولید آنزیم نوترکیب توسط باکتری­ ها فراهم شد. پس از گذشت ۵ ساعت از زمان القا، سلول های باکتری به کمک سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در حجم اولیه، در بافر تریس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت ۱۶ ساعت در °C 20- فریز شدند.
۳-۳-۲-۵- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب
در این بخش بهینه­سازی بیان پروتئین نوترکیب ابتدا با انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان TTL بر اساس میزان فعالیت آنزیمی عصاره سلولی و سپس بهینه سازی زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.
۳-۳-۲-۵- ۱- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
ساختار پلاسمید حاوی ژن آنزیم TTL به روش گفته شده در بخش ۳-۳-۲-۲ به درون باکتری منتقل شد. سپس با لیز باکتری­ ها پروتئین­های درون سلول جدا شدند (بخش ۳-۳-۲-۵) و سنجش فعالیت آنزیمی در مورد هرکدام از نمونه­ها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش ۳-۳-۶). از بین ۶ کلنی ترانسفورم شده بر اساس میزان توانایی تولید آنزیم ۱ کلنی انتخاب شد و به صورت غلیظ شده در دمای°C 20- ذخیره گردید و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۳-۲-۵-۲- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمان­های مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئین­های محلول درون سلول و میزان پروتئین­های موجود دراجسام نامحلول و پروتئین­های در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمان­های مختلف پس از القا، می­توان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپی­سیلین، ۱% تلقیح انجام شد و به مدت ۴ ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتری­ ها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به ۹/۰ رسید، ابتدا ml1 از باکتری­ ها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت ۵ دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول ۳-۵) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان ۴، ۵، ۶ و۲۴ ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونه­برداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول ۳-۶) حل شد. نمونه­ها تا زمان انجام SDS-PAGE در ۲۰- نگهداری شد.
۳-۳-۲-۶- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت ۲ تا ۳ ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آن­گاه هر ml 5 از محلول باکتری­ ها با بهره گرفتن از دستگاه سانیکاتور با شدت % ۶۰ در مراحل ۳۰ ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی ۱ دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت ۴ دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت ۱۰ دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۳-۳- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
۳-۳-۳-۱- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت ۴۰ دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت ۳۰ دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئین­های دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر^[۸۶] لیوفیلیز شد^[۸۷].
۳-۳-۳-۱-۱- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارت­دهی برای رسیدن به بیش­ترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیم­ های TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به ۶ بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (۳۰، ۴۰، ۵۰، ۶۰، ۷۰ و ۸۰ دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخ­گذاری نمونه­ها، پروتئین­های دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئین­های مقاوم به حرارت­دهی باقیمانده در محلول مربوط به ۶ نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهک­های SDS-PAGE شد(بخش ۳-۳-۵) و بهینه مدت زمان رسوب­دهی دمایی مشخص گردید.
۳-۳-۳-۲- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده ۰ تا ۵/۰ مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت ۱۵/۰)، به صورت مرحله­ ای و طی ۳ مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت ۰، مرحله دوم: غلظت ۱/۰ مولار، مرحله سوم: غلظت ۱۵/۰ مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئین­های مخلوط پروتئینی جدا گردید.
۳-۳-۴- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
۳-۳-۴-۱- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول ۳-۵ تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت ۱ تا ۲ ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل می­کنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی­لیتر می­رسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری می­کنیم.
جدول ۳-۵- نحوه تهیه محلول برادفورد

مواد مورد نیاز
مقدار

Comassie Brilliant Blue G-250
۱/۰ گرم

اتانول ۹۵%
۵۰ میلی­لیتر

فسفریک اسید ۸۵%
۱۰۰ میلی­لیتر

در روش برادفورد در اثر برهم­کنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیل­آلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد می­ شود که شدت این رنگ در غلظت­های کم پروتئین نزدیک به قهوه­ای و در غلظت­های بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در ۵۹۵ نانومتر خوانده می­ شود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازه ­گیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ۲۰،۴۰،۶۰،۸۰،۱۰۰) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونه­های حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی ۱۰۰ میکرولیتر، رقت­هایی تهیه کرده و یک میلی­لیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونه­ها اضافه گردید. طی مدت زمان ۵ تا ۱۵ دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در ۵۹۵ نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
۳-۳-۴-۲- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
۳-۳-۵- الکتروفورز ژل پلی­آکریل آمید با SDS^[88](SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئین­ها و پپتید­ها بکار می­رود. قابلیت تفکیک­کنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلی­اکریل آمید در غربال پروتئین­های مختلف است. در این روش پروتئین­ها بر اساس اندازه از هم جدا می­شوند. با جوشاندن نمونه­ها و گذاشتن آن­ها در شرایط احیا، این ملکول­ها خطی شده و SDS به آن­ها بار منفی می­دهد، که میزان بار منفی بسته به طول آن­ها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئین­ها به این صورت بر اساس اندازه­شان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعت­های متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا می­شوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
۳-۳-۵-۱- آماده سازی محلول­های الکتروفورز
محلول استوک اکریل آمید (۸/۳۰ %): ۳۰ گرم اکریل آمید و ۸/۰ گرم بیس اکریل آمید در حدود ۵۰ میلی­لیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به ۱۰۰ میلی­لیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا ۳ ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده)^[۸۹]: این بافر دارای غلظت ۵/۱ مولار تریس با ۸/۸~pH است. برای تهیه آن ۲/۱۸ گرم تریس- باز در حدود ۷۰ میلی­لیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک ۲ مولار تا ۸/۸ پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰ میلی­لیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده)^[۹۰]: این بافر دارای غلظت ۵/۰ مولار تریس با ۸/۶~pH است. برای تهیه آن ۱/۶ گرم تریس باز در حدود ۵۰ میلی­لیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک ۲ مولار تا ۸/۶ پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به ۱۰۰ میلی­لیتر رسید.
بافر الکتروفورز: ۵/۱ گرم تریس- باز، ۲/۷ گرم گلیسین و ۵/۰ گرم SDS در ۵۰۰ میلی­لیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود ۳/۸ است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلی­لیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).