۵- میکروتیوب ها را ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۶- مایع رویی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل ۱/۰ مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
۷- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
۸- این بار رسوب را در ۶۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل ۱/۰ مولار حل می کنیم .
۹- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
۱۰- سپس محلول را به مدت ۳ دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم .
۱۱- رسوب را در ۳۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
۱۲- به مدت ۲۰ دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا ۷۲ ساعت روی یخ در یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیسرول استریل ۳۰ درصد آن ها را در ۷۰- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
۳-۴-۲ ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli
بدین منظور از سویه E.coli Top10 که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم. این باکتری به تنهایی حساس به آمپی سیلین است و نمی تواند در محیط حاوی آمپی سیلین رشد نماید ولی وقتی وکتور را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک آمپی سیلین مقاوم شده و بر روی آگار حاوی آمپی سیلین رشد می کند .
۳-۴-۲-۱ روش کار:
۱- ۵۰ میکرولیتر سوسپانسیون سلولی شایسته را ابتدا روی یخ ذوب می کنیم.
۲- ۲ میکرولیتر از پلاسمید AMP⁺-pBSK حاوی DNA ناحیه C2پروتئینALCAM را به آن اضافه می کنیم .
۳- این مخلوط را به مدت ۳۰ دقیقه روی یخ قرار می دهیم .
۴- نمونه ها را به مدت ۹۰ ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و ۵ دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.
۵- مخلوط فوق را به ۹۰۰ میکرولیتر از محیط LB فاقد آمپی سیلین افزوده و آن را به مدت ۵/۱ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۷ درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
۶- مخلوط فوق را به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم .
۷- ۷۰۰ میکرولیتر از مایع رویی را دور ریخته و رسوب را در ۲۵۰ میکرولیتر باقی مانده خوب حل می کنیم.
۸- ۱۰۰ میکرولیتر را روی یک پلیت LB آگار و۱۵۰ میکرولیتر را روی یک پلیت دیگر دارای LB آگار آمپی سیلین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری می کنیم .

1. 1. 1. 1. ۹. ۱۰۰ میکرولیتر از باکتری شایسته شده که عمل ترانسفوماسیون را روی آن انجام نداده ایم برای کنترل منفی روی پلییتLB آگار کشت می دهیمبه مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری می کنیم.

         (( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

      (( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۴-۳ ارزیابی کلونی ها
پس از ۱۸ تا ۲۰ ساعت پلیت ها را ارزیابی می کنیم، پلیت داری باکتری ترانسفورم شده تشکیل کلونی داد و پلیت حاوی باکتری ترانسفورم نشده نباید تشکیل کلونی دهد چون ژن مقاومت به آنتی بیوتیک را دریافت نکرده است. پس از انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود ۱ تا ۲ میلی متر می رسد . یک تک کلونی را جدا کرده و در ۵ میلی لیتر LB براث آمپی سیلین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در ۳۷ درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم . با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری، پلاسمید حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
۳-۴-۴ استخراج پلاسمید – AMP⁺ pBSK حاوی DNA ، C2 پروتئین ALCAM
اساس استخراج پلاسمید مبتنی بر لیز قلیایی و متعاقب آن جذب DNA توسط سیلیکا^[۴۳] است و سپس جداسازی پلاسمید از ستون می باشد. برای استخراج پلاسمید از کیت تهیه شده از شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد . ( شکل ۳-۱۰ )
شکل۳-۱۰ کیت استخراج پلاسمید
روش کار :
۱- از محیط کشتLB مایع حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، ۵/۱ میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب ۵/۱ می ریزیم.
۲- سپس به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم .
۳- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تا اتمام محیط کشت۵ میلی لیتری تکرار کرد.
۴- در این مرحله ۲۵۰ میکرولیتر از بافر محلول کننده^[۴۴] که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
۵- ۲۵۰ میکرولیتر از محلول لیزکننده^[۴۵] به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را ۴ تا ۶ بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
۶- در مرحله ی بعد ۳۵۰ میکرولیتر از بافر خنثی کننده^[۴۶] به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم . سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سر و ته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
۷- سپس به مدت ۵ دقیقه در ۹۰۰۰ دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
۸- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
۹- محلول رویی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم . این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
۱۰- ستون حاوی محلول را به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم .
۱۱- محلول روئی را دور می ریزیم.
۱۲- به ستون ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو^[۴۷] اضافه می کنیم .
۱۳- به مدت ۴۵ ثانیه در ۰۰۰/۱۲ دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم .
۱۴- مرحله۱۲و۱۳ را یک بار دیگر تکرار می کنیم .
۱۵- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
۱۶- ستون را به مدت ۱ دقیقه دیگر در ۰۰۰/۱۲ دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیرا الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.ستون را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم تا الکل آن به طور کامل تبخیر شود.
۱۷- ستون را درون یک میکروتیوب ۵/۱ قرار می دهیم و سپس بافر جدا کننده ^[۴۸] را به میزان ۵۰ میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم . بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. ۲ الی ۳ دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
۱۸- به مدت ۲ دقیقه در ۰۰۰/۱۲ دور ستون را در درون میکروتیوب۵/۱ سانتریفیوژ می کنیم .