Sesame oil (Sigma)
Entelan (Merck)
Xylene (Merck)
Peroxidase hydrogen (Merck)
Anti-Caspase 3 antibody (produced in rabbit, sigma)
Peroxidase conjugated goat anti rabbit IgG (sigma)
Triton x- 100 (Merck)
Paraformaldehyde (Merck)
Sodium dihydrogen phosphate (Merck)
Di- sodium hydrogen phosphate (Merck)
غذای مخصوص موش
گیمسا

3-2- وسایل و دستگاه ها

سمپلر 10-1 میکرولیتری
سمپلر100-10 میکرولیتری
سمپلر 1000-100 میکرولیتری
ترازو
قفس وظرف آبخوری موش
سرنگ انسولینی
جعبه open field
استوانه مخصوص آزمون شنا
دستگاه ماز بعلاوه مرتفع
دماسنج
هیتر
لام و لامل بلند
وسایل تشریح
ست پرفیوژن

3-3- روش انجام کار

موش­های صحرایی سفید آزمایشگاهی(Rat) از نژاد ویستار با وزن 180 تا 220 گرم از مؤسسه سرم سازی رازی تهیه شده و در اتاق حیوانات بخش زیست­شناسی با دمای 2±22 درجه سانتیگراد و سیکل 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آب و غذا به میزان کافی در اختیار موش­ها قرار داشت. برای جفت­گیری دو موش صحرائی ماده جوان با یک موش صحرائی نر در یک قفس قرار می­گرفت. به منظور اطمینان از باردار بودن ماده­ها هر روز تست اسمیر از واژن موش گرفته می­شد. جهت تست اسمیر از موش ماده­ای که برای جفت­گیری در کنار موش نر قرار گرفته بود بوسیله قطره چکان نمونه واژینال تهیه و به لام حاوی یک قطره آب منتقل می­شد. بعد از خشک شدن نمونه، برای فیکس شدن نمونه، روی آن الکل ریخته و صبر می­کنیم تا خشک شود. و بعد روی نمونه گیمسا ریخته و ٢٠ دقیقه رنگ گیمسا را روی نمونه نگه می­داریم تا کاملا رنگ بگیرد و بعد رنگ را شسته و نمونه را زیر میکروسکوپ مشاهده می­کنیم. در صورت مشاهده اسپرم، حاملگی تأیید می­شد. پس از بررسی میکروسکوپی و در صورت تشخیص حامله بودن، موش حامله از بقیه جدا شده و در قفس مجزا نگهداری

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

می­شد. این روز به عنوان روز صفر حاملگی در نظر گرفته ­می­شد.
روز 15 بارداری، موش­های صحرایی ماده وزن شده و به صورت کاملاً تصادفی برای تیمار در یکی از گروه ­های مورد مطالعه انتخاب می­شدند. موش­های صحرایی ماده حامله به سه گروه تقسیم شدند. مادران گروه­ کنترل در کل دوران حاملگی و شیر­دهی آب معمولی دریافت
می­کردند. گروه شاهد از شروع روز پانزدهم حاملگی تا پایان روز هفت بعد از زایمان میزان 40 میلی­گرم بر کیلوگرم ساخارین در روز به صورت محلول در آب معمولی دریافت می­کردند. گروه آزمایش از روز پانزدهم حاملگی تا پایان روز هفت بعد از زایمان میزان 20 میلی­گرم بر کیلوگرم در روز داروی اتوسوکسیماید به همراه 40 میلی­گرم بر کیلوگرم ساخارین در روز را به صورت محلول با آب دریافت می­کردند. از شروع روز پانزدهم مادران باردار گروه شاهد و آزمایش با احتیاط کامل به صورت یک روز در میان وزن می­شدند. و میزان محلولی را که طی یک شبانه روز بایستی دریافت کنند تعیین کرده و در طی روز میزان محلول مصرفی به صورت متناوب به وسیله استوانه مدرج برحسب میلی­لیتر سنجیده شده پس از دریافت میزان مناسب، در ادامه روز آب معمولی در اختیار مادران قرار می­گرفت. تقریبا 21 روز بعد از شروع بارداری، موش صحرایی حامله زایمان می­ کند که روز اول زایمان را روز صفر تولد در نظرگرفته و فردای آن، به عنوان روز اول پس از تولد ثبت می­شد. در روز اول پس از تولد در صورتی که تعداد نوزادان بیش از 8 سر بود تعداد 8 سر به صورت تصادفی انتخاب شده و بقیه پس از بیهوشی عمیق قربانی می­شدند. مادر و نوزادها به طور یک روز درمیان وزن می­شدند تا میزان محلول ساخارین و اتوسوکسیماید- ساخارین دریافتی تا روز 7 بعد از تولد مشخص شود.
در روز 9 پس از تولد از بین نوزادان هر مادر یک نر و یک ماده جهت پرفیوژن ترنس­کاردیال و مطالعه مرگ نورونی آپاپتوتیک در هسته سجافی پشتی استفاد می­شدند. نوزادان باقی مانده در روز 25 پس از تولد از مادر جدا می­شدند و در روز 40 پس از تولد زاده­های نر و ماده از هم تفکیک می­شدند. از روز 60 بعد از تولد آزمون اضطراب در ماز بعلاوه مرتفع و شنای اجباری بر روی موش­های صحرایی انجام می­شد.

شکل 3-1- تست اسمیر (اسپرم­های موش صحرایی)

3-4- آزمون حرکتی Open field

قبل از آزمون رفتاری، موش­های صحرایی وزن شدند و برای اطمینان از صحت فعالیت حرکتی موش­های صحرایی آزمون Open field انجام گرفت.
آزمون Open field یک آزمون حسی– حرکتی ساده[33] است که فعالیت پایه حیوانی[34] و تکامل آن در پاسخ به محیط جدید یا محیط اضطراب­زا و درمان دارویی و ضایعه یا اصلاح ژنتیکی را مورد ارزیابی قرار می­دهد (Denenberg, 1969).
جعبه Open field به شکل مکعبی با ابعاد40×40×40 است. کف آن با دو خط متقاطع به 4 قسمت برابر تقسیم شده است. تعداد دفعاتی که یک موش صحرایی در مدت 300 ثانیه از این خطوط عبور می­ کند به عنوان شاخصی از فعالیت حرکتی موش صحرایی در نظر گرفته می­ شود.

شکل 3-2- دستگاه تست فعالیت حرکتی

3-5- ماز بعلاوه مرتفع [35]

دستگاه ماز بعلاوه مرتفع دستگاهی است به شکل بعلاوه، با دو بازوی باز و دو بازوی بسته که در ارتفاع 70-40 سانتیمتری از سطح زمین قرار گرفته­ است. آزمون ماز بعلاوه یک آزمون نسبتاً جدید برای شناسایی سطح اضطراب و نیز تأثیر داروهای اضطراب­زا و ضد اضطراب در موش صحرایی است. بطور طبیعی موش ها ورود کمتری به بازوهای باز، نسبت به بازوهای بسته دارند و در نتیجه به نسبت، زمان کوتاهی را در بازوهای باز می­گذرانند. کاهش ماندن در بازوهای باز به نسبت ماندن در بازوهای بسته، بیشترین ارتباط را با رفتارهای اضطرابی و غلظت­های بالای کورتیکواسترون پلاسمای موش دارد (Hogg, 1996).

شکل 3-3- دستگاه ماز بعلاوه مرتفع

3-6- آزمون شنای اجباری[36]

این تست بر اساس فرار از محرک آزار دهنده پایه­گذاری شده است و غالباً برای اندازه گیری اثر داروهای ضدافسردگی مورد استفاده قرار می­گیرد. در این روش موش در یک استوانه شفاف پر شده از آب با درجه حرارت بین ℃30-24 قرار می­گیرد، به صورتی که نمی­تواند فرار کند. ارتفاع استوانه 30 سانتیمتر و قطر آن 20 سانتیمتر است. عمق آب باید به اندازه­ای باشد که حیوان نتواند کف استوانه را با پا یا دم خود لمس کند موش در ابتدا برای فرار از این وضعیت تلاش می­ کند، اما بعد از مدتی بی­حرکت می­ شود. که این عدم تحرک به صورت شناور ماندن به حالت غیرفعال و یا فقط ایجاد حرکات لازم برای شناور ماندن مشخص می­ شود و شاخصی از میزان افسردگی است. رفتار موش در مدت زمان تلاش برای یافتن راهی برای خروج و نیز مدت زمان عدم تحرک ثبت و محاسبه می­ شود. این تست در دو جلسه انجام ­می­شد، به صورتی که در روز اول موش به مدت 15 دقیقه درون استوانه قرار می­گرفت و رفتار موش در 5 دقیقه اول ثبت می­شد. 15 دقیقه بعد از اتمام جلسه اول به موش داروی فلوکستین با غلظت mg/kg10 به صورت داخل صفاقی تزریق می­شد. به همین ترتیب، موش 20 و 23 ساعت بعد از آغاز جلسه اول این غلظت از فلوکستین را دریافت می­کرد. جلسه دوم آزمون شنای اجباری به مدت 5 دقیقه انجام و ثبت می­گردید. نتایج حاصل از این آزمایش به این صورت تفسیر می­ شود که زیاد بودن مدت زمان عدم تحرک، یک رفتار مرتبط با روحیه منفی و نوعی ناامیدی (افسردگی) در موش است.

شکل 3-4- آزمون شنای اجباری

3-7- آماده ­سازی محلول­های پرفیوژن

برای تهیه بافر فسفات 2/0 مولار، 56/1 گرم فسفات سدیم مونوبازیک و 07/7 گرم از فسفات سدیم دی بازیک را در 200 میلی­لیتر آب مقطر حل می­کنیم، سپس حجم محلول را به 250 میلی­لیتر می­رسانیم.
برای تهیه پارافرمالدئید 8%، 12 گرم پارافرمالدئید به 150 میلی­لیتر آب مقطر اضافه کرده و ضمن مخلوط کردن تا دمای 67 درجه سانتیگراد حرارت می­دهیم. سپس به آهستگی یک قطره محلول سود 1 نرمال اضافه می­کنیم تا محلول بیرنگ شود. سپس محلول را از کاغذ صافی عبور داده و پس از سرد شدن در ظرف در بسته و در یخچال نگهداری می­کنیم. به منظور آماده ­سازی پارافرمالدئید 4% در بافر فسفات 1/0 مولار، حجم­های مساوی از بافر فسفات 2/0 مولار و پارافرمالدئید 8% را به هم می­افزائیم.

3-7-1- پرفیوژن و خارج کردن مغز از جمجمه

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...