مقدار مورد استفاده برای انجام RFLP برای ژن CAT در هر نمونه بصورت زیر می­باشد:
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

1. 1. آب استریل: 5/17 میکرولیتر

1. 1. آنزیم محدودکننده EcoRV: 5/0 میکرولیتر

1. 1. بافر H: 2 میکرولیتر

1. 1. محصول PCR : 10 میکرولیتر

پس از تهیه­ مخلوط فوق آن را spin downکرده، و آن را به مدت30/16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار می­دهیم.
3-7: الکتروفورز
3-7-1: مواد مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز

1. 1. آگاروز

1. 1. TBE 5X

1. 1. TBE 0/5X

1. 1. 6x loading buffer

1. 1. DNA ladder

1. 1. اتیدیوم بروماید

3-7-2: طریقه­ی تهیه­ محلول­های مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز
– TBE 5X
54 گرم Tris base و 5/27 گرم Boric Acid را وزن کرده و در داخل شیشه­ی یک لیتری می­ریزیم و 20 میلی لیتر EDTAرا بر روی آن ریخته سپس مقدار کمی آب به آن اضافه می­کنیم و خوب هم می­زنیم و پس از هم زدن حجم آن را به 1000 می­رسانیم.
– TBE 0/5X
100 میلی لیتر از TBE 5X را با 900 میلی لیتر آب تصفیه شده مخلوط کرده و پس از هم زدن خوب TBE 0/5X برای استفاده آماده است.

• • محلول اتیدیوم بروماید برای رنگ آمیزی ژل

1. 1. میکرولیتر از رنگ اتیدیوم را در 700 میلی لیتر TBE 0/5X حل می­کنیم

• • محلول EDTA

38/5 گرم EDTA را در 30 میلی لیتر آب تصفیه شده حل کرده و PH آن به 8 می­رسانیم
3-7-3: الکتروفورز GSTM1 و GSTT1 و رنگ آمیزی ژل
پس از انجام PCR قطعات DNA حاصل را در چاهک­های ژل اگارز %5/1 load کرده (جهت درست کردن ژل آگاروز از مایکروفر استفاده می شود) و پس از اتصال جریان برق DNA چون دارای بار منفی هست به طرف قطب مثبت حرکت کرده، وقتی بر روی ژل مسافتی بیش از نصف طول ژل را طی کرد آن را در درون رنگ اتیدیوم بروماید در حدود 10 دقیقه قرار می­دهیم و پس از رنگ­آمیزی در دستگاه Gel Documentation آن را مشاهده خواهیم کرد. اگر شخص مورد نظر برای هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 نول باشد، فقط یک باند که مربوط به ژن بتا-گلوبین است دیده خواهد شد، که طول این باند 268 جفت باز می­باشد. اگر شخص مورد نظر برای ژن GSTT1 نول باشد، باند مربوط به ژن بتا-گلوبین و ژن GSTM1دیده خواهند شد، که طول این باندها به ترتیب 268 و 219 جفت باز می­باشند. اگر فردی هر دو تا ژن GSTM1 و GSTT1 را داشته باشد سه باند ژنی که مربوط به ژن های GSTT1، بتا-گلوبین و GSTM1 است دیده خواهند شد. که طول آنها به ترتیب 459، 268 و 219 جفت باز می باشند. در شکل 1-3 ژنوتیپ مربوط چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1 نشان داده شده است.
شکل 3-1- یک نمونه از آنالیز multiplex-PCR مربوط به چندشکلی ژن های GSTM1 و GSTT1
خط1: مارکر 100 جفت بازی، خط2: present/GSTT1-present GSTM1-، خط3: null/GSTT1-present GSTM1-، خط4: null/GSTT1-null GSTM1-، خط5: present/GSTT1-null GSTM1-
3-7-4- الکتروفورز PCR-RFLP برای ژن کاتالاز و رنگ­آمیزی ژل
قطعات DNA حاصل ازPCR-RFLP را جهت تعیین ژنوتیپ کاتالاز بر روی چاهک­های ژل آگارز 5/1 درصد load کرده و پس از اتصال جریان برق DNA چون دارای بار منفی هست به طرف قطب مثبت حرکت کرده، وقتی بر روی ژل مسافتی بیش از نصف طول ژل را طی کرد آن را در درون رنگ اتیدیوم بروماید در حدود 10 دقیقه قرار می­دهیم و پس از رنگ آمیزی در دستگاه Gel Documentation آن را مشاهده خواهیم کرد.
بر روی ژل سه نوع ژنوتیپ دیده می­ شود که عبارتند از: CC، CT، T
ژنوتیپ CC که ژنوتیپ وحشی ژن C-262T است توسط آنزیم EcoRV برش خورده و باعث ایجاد باندهای 157 و33 جفت بازی می­ شود. اگر ژن کاتالاز 262- جایگاهی برای برش آنزیم EcoRV نداشته باشد فقط یک باند 190 جفت بازی بر روی ژل مشاهده می­ شود که نشان دهنده ژنوتیپ TT می­باشد. و اگر یکی از رشته ها جایگاه برش داشته باشد و دیگری نداشته باشد بر روی ژل سه باند 190، 157و 33 جفت بازی مشاهده می­ شود که نشان دهنده‌ی ژنوتیپ CT می­باشد. در شکل 3-2 ژنوتیپ این چند شکلی دیده می­ شود.
شکل 3-2- باندهای حاصل از تاثیر آنزیم EcoRV بر روی محصول PCR
بر روی ژل آگاروز و ایجاد ژنوتیپ­های CC، CT و TT
3-8: تحلیل آماری داده ­ها